Mikroskop

Jak vznikl mikroskop?

První mikroskop sestrojili kolem roku 1590 bratři Zacharias a Jan Jannesové v Nizozemsku. Pro svou nepatrnou zvětšovací a rozlišovací schopnost nebylo možno tohoto přístroje používat k vědecké práci. Teprve kolem roku 1650 jej zdokonalil Antony van Leeuwenhoek, který jako první objevil neznámý dosud svět drobnohledných ústrojenců a vytvořil základy nejen mikroskopické techniky (mikroskopie a mikrotechnika), ale ve skutečnosti i základy mikrobiologie jako samostatné vědy. Optickou teorii mikroskopu vytvořil kolem roku 1873 německý fyzik E. Abbe. Ve svém dalším velmi živém vývoji se stal mikroskop nepostradatelným prostředkem poznání nejen ve vědách biologických (včetně lékařství), ale i přírodních a technických.

Co to vlastně je mikroskop?

Mikroskop je dokonalejší přístroj než lupa, určený rovněž k pozorování drobných předmětů. Zatímco lupou lze dosáhnout maximálního zvětšení kolem čtyřiceti, může mikroskop zvětšovat dvoutisíckrát až třítisíckrát. Vlastní mikroskop se skládá ze tří základních částí:
- z optické soustavy
- Osvětlovací soustavy
- Mechanického zařízení

Optická soustava mikroskopu je složena ze tří hlavních součástí:
objektivu, okuláru a tubusu. Úkolem objektivu je vytvořit zvětšený, skutečný a převrácený obraz předmětu (který se klade za jeho předmětové ohnisko) ve vzdálenosti D od obrazového ohniska. Úkolem okuláru je pak umožnit pozorování tohoto obrazu neakomodovaným okem. Předmětové ohnisko okuláru musí být tedy vzdáleno od od obrazového ohniska objektivu o D . Nastavení této vzájemné polohy objektivu a okuláru zajišťuje tubus. Veličina D se nazývá optickou délkou /intervalem) mikroskopu.
Způsob konstrukce optické soustavy jako celku závisí na určení a způsobu využití mikroskopu. Optické soustavy jsou konstruovány buď pro pozorování jedním okem (monokulární mikroskopy), nebo oběma očima (binokulární mikroskopy). Binokulární mikroskopy jsou výhodnější, neboť při pozorování oběma očima dochází k menší únavě. Optická soustava binokulárního mikroskopu je buď složena ze dvou samostatných monokulárních soustav (stereoskopický mikroskop), nebo je tvořena dvěma okuláry a jedním společným objektivem.
Všimneme si podrobněji způsobu konstrukce a vlastností objektivu a okuláru. Základními parametry objektivu jsou ohnisková vzdálenost ¦ób , příčné zvětšení bo a číselná apertura A. Pro příčné zvětšení platí vztah
bo= D ¤ ¦ób

Ohnisková vzdálenost objektivu nebývá zpravidla menší než 1,50mm a pro slabé objektivy může být 20 až 30 mm.Optická délka tubusu leží obvykle v rozmezí hodnot 150 až 200 mm. Odtud pro maximálně dosažitelné zvětšení plyne hodnota poněkud přesahující 100.

Ohnisková vzdálenost Zvětšení (délka tubusu D=170mm) Číslo apertura Druh
39,1 3x 0,10 suchý
24,2 6x 0,15 suchý
16,9 10x 0,30 suchý
9,1 20x 0,45 suchý
6,1 30x 0,65 suchý
4,1 45x 0,65 suchý
3,1 60x 0,85 suchý
1,95 100x 1,25 Olej.imerse

Parametry mikroskopických objektivů Meopta.

Jak uvidíme později, je pro posouzení jakosti objektivu velmi důležitá jeho číselná apertura A=N sin sA . Je-li prostor mezi krycím sklíčkem předmětu a objektivem vyplněn vzduchem o indexu lomu N = 1, je teoreticky maximálně dosažitelná hodnota číselné apertury 1. Prakticky je možno získat nejvýše hodnotu 0,95. Hodnotu číselné apertuty lze zvětšit použitím tzv. imerse, která spočívá v tom, že se prostor mezi objektivem a krycím sklíčkem vyplní prostředím o indexu lomu N > 1. K tomuto účelu se obvykle užívá vhodné kapaliny. Tak např. s použitím monobromnaftalenu, který má velký index lomu, je možno dosáhnout hodnoty A=1,6. Kromě monobromnaftalenu se také často užívá vody, nebo cedrového oleje, který má tu zvláštní vlastnost, že jeho index lomu je velmi blízký indexu lomu skla. V tomto případě mluvíme o tzv. homogenní imersi.
Dalším kritériem jakosti objektivu je stupeň korekce jednotlivých vad. Podle stupně, jakým jsou korigovány zejména barevné vady, rozeznáváme tzv. achromáty, poloachromáty a apochromáty.

Jako okuláru se u mikroskopu užívá pro běžné pozorování okuláru Huygensova. Huygensův okulár je složen ze dvou ploskovypuklých čoček, obrácených rovinnými plochami k oku. První z obou čoček, bližší k oku, se nazývá čočka oční, druhá má název kolektiv. Zvláštností Huygensova okuláru je, že má virtuální předmětovou ohniskovou rovinu mezi kolektivem a oční čočkou. V důsledku toho je u mikroskopů s Huygensovým okulárem nutno umístit clonu zorného pole dovnitř optické soustavy okuláru. Tato clona se zpravidla umisťuje do předmětové ohniskové roviny oční čočky. V tomto případě padne totiž vstupní průhled soustavy mikroskopu do roviny předmětu a zorné pole je ostře ohraničeno.Do předmětového ohniska roviny oční čočky se často vkládá planparalelní deska se stupnicí. Takto vybavený okulár, kterým je možné měřit rozměry pozorovaného předmětu, se nazývá okulární mikrometr. Dělení stupnice bývá zpravidla rovno 1/10 nebo 1/20 mm. Skutečná hodnota jednoho dílku vzhledem k rozměrům předmětu (tzv. mikrometrická hodnota) závisí však na zvětšení objektivu a kolektivu okuláru. Proto je nutné před měřením provést kalibraci tak, že na stolek mikroskopu umístíme mikrometrickou stupnici (objektivový mikrometr) známého dělení a její dělení srovnáme s dělením stupnice okulárního mikrometru.
Kromě Huygensova okuláru se v měřicích mikroskopech užívá často okuláru Ramsdenova. Předmětové ohnisko tohoto okuláru je reálné a leží před jeho optickou soustavou. Proti Huygensovu okuláru má tedy nevýhodu v tom, že je optická soustava mikroskopu delší. Na druhé straně dává lepší možnost umístění mikrometrické stupnice, která se v tomto případě pozoruje celou soustavou okuláru.
Pro náročnější účely se mimo Huygensův a Ramsdenův okulár užívá složitějších typů okulárů (např. okuláry periplantické nebo ortoskopické), které mají lépe korigovány jednotlivé druhy vad a dovolují použít většího zvětšení a zorného pole.
U běžných druhů okulárů se pohybuje ohnisková vzdálenost mezi 50 a 10 mm. Tomu odpovídá zvětšení 5-25 .

Pořadové číslo Druh Ohnisková vzdálenost (mm) Zvětšení
1 Huygensův okulár 41,7 6
2 Huygensův okulár 31,3 8
3 Huygensův okulár 25,0 10
4 Huygensův okulár s mikrometrem 31,3 8
5 Periplantický okulár 25,0 10
6 Periplantický okulár 16,7 15
7 Periplantický okulár 12,9 20
Parametry okulárů Meopta

Pro měřicí úkoly se kromě již popsaných okulárních mikrometrů často používají tzv. měřicí okuláry, které mají v rovině clony umístěnu jednak planparalelní desku se stupnicí, jednak pohyblivou značku, eventuálně nitkový kříž. Pohyb této značky je ovládán mikrometrickým šroubem se stupnicí, takže lze odečítat velmi malé hodnoty posuvu.
Na vlastnostech objektivu a okuláru jsou závislé vlastnosti optické soustavy mikroskopu jako celku. Optická soustava mikroskopu je charakterizována hlavně zvětšením , zorným polem a rozlišovací schopností.

Osvětlovací soustava mikroskopu zajišťuje osvětlení pozorovaného předmětu. Mikroskopem mohou být pozorovány předměty průhledné i neprůhledné. V prvním případě se předmět osvětluje procházejícím světlem, v druhém případě světlem odraženým.
Způsob konstrukce osvětlovací soustavy závisí zřejmě na tom, k jakému druhu pozorování bude mikroskop použit. Především záleží na tom, půjde-li o pozorování v procházejícím nebo odraženém světle. Kromě toho je v obou případech možné konstruovat osvětlovací soustavu pro práci v tmavém nebo ve světlém poli. Velmi často jsou mikroskopy zařízeny pro práci v polarizovaném světle, v takovém případě bývají osvětlovací soustavy vybaveny polarizátorem.
Pro náročnější účely se k osvětlení preparátu užívá výhradně umělých zdrojů, které bývají zpravidla malých rozměrů. Aby se využilo celé apertury objektivu, je v tomto případě nutné použít kondenzor, kterým se zobrazí zdroj do roviny předmětu. Optická soustava kondenzoru musí mít ovšem dostatečně velkou aperturu.

Dále se budeme podrobněji zabývat jednotlivými parametry optické soustavy jako celku, a to zejména způsoby jejich zjišťování.
Zvětšení. Zvětšení mikroskopu Zm je podobně jako u lupy definováno poměrem
Zm = u ¤ u´
U´je úhel, pod kterým vidíme obraz předmětu, vytvořený mikroskopem neakomodovaným okem, u je úhel, pod kterým vidíme tentýž předmět prostým okem z konvenční zrakové vzdálenosti. Označíme-li bo příčné zvětšení objektivu a Zo zvětšení okuláru, platí
Zm = bo . Zo
V případech, kdy nejsou hodnoty bo k dispozici, lze zjistit zvětšení měřením přímou metodou. Uspořádání této metody je modifikací metody použité pro lupu. Při měření položíme nejprve na stolek mikroskopu objektivový mikrometr M. Těsně před okulár umístíme polopropustné zrcátko Z tak, aby svíralo s osou tubusu úhel 45°. Ve vzdálenosti 25 cm od zrcátka umístíme milimetrové měřítko S rovnoběžné s osou tubusu tak,abychom je mohli současně porovnat s obrazem mikrometrické stupnice vytvořeným mikroskopem . Srovnáním dělení obou stupnic lze pak určit zvětšení mikroskopu. Nastavíme-li však mikroskop tak, abychom viděli obě stupnice ostře, pozorujeme obraz v mikroskopu okem akomodovaným na konvenční zrakovou vzdálenost a zvětšení, které takto měříme, není totožné se Zm podle vztahu Zm = bo . Zo . Označíme-li toto naměřené zvětšení Zo a předpokládáme-li, že zvětšení objektivu zůstává v obou případech stejné, dostaneme rovnici: Zd = bo (d ¤ ¦ok + 1 ) = Zm + b
Zm = Zd - b

K praktickému měření zvětšení mikroskopu přímou metodou lze také použít kreslicího zařízení, které se někdy dodává jako příslušenství mikroskopu. Toto zařízení se skládá ze skleněné krychle složené ze dvou pravoúhlých hranolů a z rovinného zrcadla. Krychle je vsazena v objímce, která se nasadí na tubus mikroskopu tak, aby krychle byla umístěna před okulárem. Vzhledem k tomu, že přeponová stěna jednoho z hranolů je polopropustně pokovena, může krychle působit stejně jako polopropustné zrcadlo.
Pomocí kreslicího zařízení je možné současně pozorovat obraz předmětu vytvořený mikroskopem a list papíru položený vedle mikroskopu. Vhodný poměr jasů obou obrazů bývá možné dosáhnout pomocí některého filtru, jimiž bývá zařízení vybaveno.
Zorné pole. Předmětové ohnisko celé soustavy leží v blízkosti předmětové roviny objektivu, její obrazové ohnisko leží poblíž oční čočky okuláru; do obrazové ohniskové roviny se zpravidla klade oční pupila. Aperturní clonu mikroskopu tvoří buď obruba některé čočky objektivu, nebo clona umístěná v blízkosti obrazového ohniska objektivu. Vstupní pupila celé soustavy je pak obraz této clony vytvořený čočkami objektivu ležícími „před“ ní a výstupní pupila je obraz vytvořený čočkami soustavy ležícími „za“ ní. Výstupní pupila leží vždy velmi blízko obrazové ohniskové roviny celé soustavy. Průměr výstupní pupily mikroskopu je ve většině případů menší než průměr oční pupily.
Vzhledem k uvedeným okolnostem může být oční pupila umístěna vždy do roviny výstupní pupily soustavy. Zorné pole, které můžeme pozorovat, je tedy omezeno jen clonou zorného pole okuláru. Zorné pole mikroskopu je pak v lineární míře definováno jako průměr toho kruhu v předmětové rovině, jehož obraz vyplní celou plochu clony zorného pole okuláru.
Jsou 2případy : buď je clona zorného pole umístěna „před“ optickou soustavou okuláru (Ramsdenův okulár), nebo je umístěna uvnitř jeho optické soustavy (Huygensův okulár).
Označíme-li dz průměr clony zorného pole, bude v prvním případě zorné pole mikroskopu rovno :
rm = dz ¤ bo
a v druhém případě :
rm = Dz ¤ bo
Dz = dz. ¦´ok ¤ ¦ć , ¦´ok je ohnisková vzdálenost okuláru a ¦ć ohnisková vzdálenost oční čočky. Veličina Dz vyjádřená v milimetrech se nazývá číslo zorného pole okuláru

Huygensovy okuláry
Zvětšení Číslo zorného pole
6 18,4
8 16,2
10 13,4

Periplanatické okuláry
Zvětšení Číslo zorného pole
10 16,6
15 13,6
20 8,7

Rozlišovací schopnost. Pro rozlišovací schopnost mezí optické soustavy d byl uveden vztah :d = 0,61. l ¤ A , v němž l je vlnová délka a A číselná apertura. K tomuto vztahu se dospělo ze studia difrakce vznikající při průchodu světelných paprsků vycházejících ze dvou svítících bodů. Při kolmém osvětlení vychází pro rozlišovací dm platí vztah : dm = l ¤ A
Menší mez rozlišení lze dosáhnout při šikmém osvětlení. Za předpokladu, že aperturní úhel kondensoru je roven aperturnímu úhlu objektivu, platí pro rozlišovací mez : dm = l ¤ 2A
Danou rozlišovací mezí je také omezeno použitelné zvětšení mikroskopu. ˇUsečku délky do, kterou vidíme z konvenční zrakové vzdálenosti d pod úhlem u = do ¤ d , pozorujeme mikroskopem pod úhlem u´= do Zm ¤ d . Má-li být tato vzdálenost rozlišena okem, musí být u´>1´. Na druhé straně nemá cenu smysl zvětšovat u´daleko nad tuto hranici zvětšování Zm. Při dané vlnové délce a číselné apertuře nelze totiž na předmětu rozlišit více detailů. Obvykle se pro u´volí hranice 1´< u´<4´.
Zvětšení, které nevyhovuje nerovnosti 250A < 1000A se nazývá prázdné.
Experimentálně se rozlišovací schopnost určuje pozorováním předmětů majících dostatečně jemnou strukturu. Pro kvalitní posouzení se užívá různých přírodních preparátů, jako např. šupin motýlích křídel apod. Kvantitativně je možno rozlišovací schopnost posoudit užitím testovacích desek s dostatečně jemným dělením podobně jako v případě lupy.

Druhy mikroskopů..

Optický mikroskop je mikroskop, v němž je obraz zvětšován dvěma sadami spojných čoček:objektivem a okulárem. V biologii se pro účely optické mikroskopie užívají objektivy různé síly, tj. různé zvětšovací schopnosti ; okulár již jen zvětšuje obraz vržený objektivem. Největší zvětšení , kterého jde docílit v obyčejném světle , je asi 1500krát , kdy má optický mikroskop ještě využitelnou rozlišovací schopnost. Při použití nejsilnějších objektivů je nutno vložit mezi frontální čočku a krycí sklíčko mikroskopického preparátu kapku cedrového oleje se stejným lomem světla, jako má sklo,aby se světlo neztrácelo ( imerzní objektivy ) . Vyššího zvětšení lze docílit použitím světla o kratší vlnové délce, jako je ultrafialové světlo. Optický mikroskop byl sestrojen v roce 1590 v Nizozemsku a byl zdokonalen A. van Leeuwenhoekem 1650, v současnosti existuje řada aplikací.

Fluorescenční mikroskop – používá se zde ultrafialových paprsků, z elektrických obloukových lamp nebo ze rtuťových výbojek, které vyvolají světélkování předmětu v mikroskopu. Při osvětlení předmětu světlem , které nedopadá do objektivu, lze mikroskopem pozorovat částice průměru asi setiny mikronu, avšak nelze rozeznat jejich tvar..

Ultramikroskop zkonstruoval v roce 1903 H. Siedentopf a R. Zsigmondy. Pro zobrazení ještě menších částic je třeba použít místo světelných paprsků proudu elektronů, které se uvolňují ze žhavých kovů uvedených na záporný potenciál. Proud elektronů prochází elektr. n. magnet. čočkami, tj. elektr. n. magnet. polem, které umožňuje měnit směr pohybu elektronů.

Elektronový mikroskop pracuje s proudem elektronů ve vakuu. Proud elektronů –záření velmi malé vlnové délky. Elektronové mikroskopy se dělí na 2 druhy : transmisní elektronový mikroskop
Rastrovací elektronový mikroskop
TRANSMISNÍ ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP : viditelný obraz se vytváří na fluorescenčním stínítku svazkem elektronů, které prošly studovaným vzorkem, nebo které ve vzorku difraktovaly. Zdrojem proudu elektronů je kovová katoda, která po rozžhavení vysílá elektrony urychlované el. polem o napětí 50-200kV. Proud elektronů prochází tzv. elektronovou čočkou, kterou tvoří el. pole zvláštního kondenzátoru, nebo mag. pole cívky. Tato elektronová čočka soustřeďuje elektrony na pozorovaný předmět (preparát). Vrstva preparátu musí být velmi tenká, přibližně 1 mm, aby nepohlcovala elektrony . Proud elektronů pak prochází další elektronovou čočkou- objektivem a vytvoří první elektronový obraz. Část tohoto obrazu se elektronovou čočkou- projektivem- znovu zvětší a výsledný obrazec se promítá buď na stínítko pokryté vrstvou luminoforu, nebo se zachytí na fotografické desce či filmu. Tyto , a samozřejmě i další součásti elektronového mikroskopu jsou uloženy ve vzduchotěsné válcové nádobě, z níž je vyčerpán vzduch, aby se prou elektronů nezeslaboval. K přípravě vzorků pro transmisní elektronový mikroskop se používá několik metod :Metoda obtisků (replik) – povrch silnější než 10-50 nm se pokrývá replikou. To může být např. roztok celulózy, který se nakápne na pozorovaný povrch a nechá se roztéct. Po zaschnutí repliku sejmeme a pozorujeme.
: Příprava ultratenkých řezů- používá se zařízení zvané ultramikroton. Obsahuje fixní skleněný nůž a masivní ocelovou tyč, na níž je upevněn vzorek. Tyč se otáčí a je ohřívána průchodem proudu, čímž dojde k jejímu prodloužení a uříznutí části vzorku
: elektrochemické leptání – vzorek (cca 100 mm ) je elektrochemicky leptán nebo iontově poprašován. V místě, kde se vzorek proleptá jej pozorujeme.

RASTROVACÍ ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP : Rastrovací elektronový mikroskop pracuje tak, že na vzorek dopadá tenký svazek elektronů, který dopadá postupně na všechna místa vzorku. Odražený (emitovaný) paprsek se převádí na viditelný obraz.
Mechanická clona – vybírá pouze část elektronů, které dopadnou na preparát.
Projekční čočka – způsobí, aby zaostřený svazek elektronů dopadl na preparát. Zaostřený svazek elektronů musí po povrchu preparátu rastrovat synchronně s TV.
Rozlišujeme 4 skupiny elektronů opouštějící povrch vzorku:
1) zpětně odražené elektrony – poskytují informaci o topografii (reliéfu) vzorku a o materiálovém složení. Jejich rozlišovací schopnost je 50-200nm.
2) Sekundární elektrony – poskytují informaci převážně topografickou. Rozlišovací schopnost je 5-15 nm.
3) Augerovy elektrony – jsou vyráženy z materiálu a zjištěním jejich energie lze provádět prvkovou (kvalitativní) analýzu
4) Primární elektrony – detekují se jako u transmisního elektronového mikroskopu (0,5nm)

Dále pak můžeme detekovat i RTG záření nebo i viditelné světlo, což nám umožní získat další informace o zkoumaném vzorku. Vzorek může být 2-3 cm tlustý a 15 cm dlouhý a musí být kvalitně pokoven.

Výhody a nevýhody elektronové mikroskopie

Mezi největší výhody patří velmi velké zvětšení – řádově až 1 000 000 , což umožňuje pozorovat i opravdu velmi malé částice. U transmisních el. mikroskopů je nutné, aby vzorek byl velmi tenký, což lze považovat za nevýhodu. Další podstatná nevýhoda je to, že preparát musí být umístěn ve vakuu, což neumožňuje pozorovat živé organismy. El. mikroskop má také velké rozlišení (0,1 nm) a velkou hloubkou ostrosti (několik mm). Pohyb svazku elektronů lze řídit pomocí počítače , což umožňuje využít veškerý komfort, který tato technika poskytuje (zobrazit pouze výřez , odstranit šum snížením rastrovací rychlosti, tisknout obraz…). Výhoda je také to, že elektronový mikroskop může dát informaci nejen o topografii vzorku, ale i o jeho materiálovém složení. Za nevýhody lze dále považovat i velké nároky na prostor a vysokou pořizovací cenu.
Elektronová mikroskopie se používá při studiu velmi malých částic, například v lékařství při studiu bakterií a virů. Jiné uplatnění nalézá např. v mikroelektronice, kde se využívá při vývoji a studiu čipů a polovodičových materiálů. Vzhledem k tomu, že dráhy elektronů ovlivňují také případné mag. pole povrchové vrstvy vzorku, můžeme např. pozorovat mag. pole, které vytváří pracující polovodičová součástka. Mikroskop se využívá i ke kvalitní (prvkové) analýze např. v chemii, biologii atd.

Dále existuje mikroskop interferenční, který se využívá zejména v technické praxi, např. ve strojírenství .
Polarizační mikroskop je určen pro studium optických vlastností krystalů. Tento mikroskop má v osvětlovacím zařízení a v tubusu zařazeno dvojí polarizační zařízení, které je otočné kolem optické osy.
Stereoskopické mikroskopy dávají plastický obraz.
Mikroskopy můžeme i fotografovat, dále se používá přístroj zvaný mikromanipulátor, který umožňuje operaci na buňkách za pomoci speciálních zařízení (mikrurgie)..

Seznam použité literatury :

Fyzika . Jaroslav Vachek

Základy fyzikálních měření . Jaromír Brož a kol.

Příruční slovník naučný III.

Všeobecná encyklopedie 5 m/o

Internet